WSR040-PCR, Sequenzierung und NGS: Aufklärung der DNA - Interview mit Dr. Jörn Glökler

Wirkstoffradio (MP3 Feed)

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Bernd hat sich mit seinem Gesprächspartner, Dr. Jörn Glökler, remote zusammengesetzt, da es in der derzeitigen Pandemie nicht anders möglich ist. Sie haben über PCR und Sequenzierung gesprochen. Jörn ist Senior Scientist an der Technischen Hochschule Wildau, und auch Mitarbeiter bzw. Berater bei einigen Biotech Unternehmen.

Dr. Jörn Glökler

Seit Anfang 2020 verbreitet sich auch in Deutschland die SARS-CoV-2 Pandemie. Dabei sind PCR-Tests wichtige Werkzeuge, um Patienten mit COVID-19 zu identifizieren. Über Sequenzing oder Sequenzierung spricht man in diesem Zusammenhang dann, wenn nach einem positiven Test auch die Variante des Virus bestimmt wird. Diese Verfahren sind nicht nur für Arbeiten in der aktuellen Pandemie wichtig, sondern gelten mittlerweile als Standard-Werkzeuge in Diagnostik und Forensik.

Wie diese Techniken genau funktionieren, woher sie kommen, wo diese noch angewendet werden und woran Wissenschaftler aktuell bei der Weiterentwicklung dieser Techniken arbeiten, lässt sich Bernd von Jörn in dieser Episode erklären.

(Im Podcast gibt es Kapitelmarken, die den Zwischenüberschriften hier im Text entsprechen, so dass es einfacher ist, bestimmte Teile erneut zu hören. Nicht jede Kapitelmarke hat eine Zwischenüberschrift, manchmal fassen wir mehrere Kapitel zusammen.)

Was bedeutet PCR?

• • Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – Wikipedia Artikel
  • Kary Mullis – Wikipedia Artikel
  • Nukleotide – Wikipedia Artikel
  • Triphosphate – Wikipedia Artikel
  • Pyrophosphate – Wikipedia Artikel

Primer Definition

• • Primer – Wikipedia Artikel
  • Oligonukleotide – Wikipedia Artikel

Polymerasetypen

• • Polymerasen – Wikipedia Artikel

Die drei Schritte der technischen PCR

Ein PCR-Versuch hat drei Phasen:

1. 1. Primerbindung
   2. Kopiereaktion: Gegenstrang der DNA-Sequenz wird gebildet.
   3. Denaturierung: Doppelstrang wird aufgeteilt

• • Klenow-Fragment – Wikipedia Artikel

Taq-Polymerase

• • Extremophilie – Wikipedia Artikel
  • Thermus aquaticus – Wikipedia Artikel
  • Taq-Polymerase – Wikipedia Artikel
  • Escherichia coli – Wikipedia Artikel

Was heißt überexprimiert?

• • Überexpression – Wikipedia Artikel

Automatisierung der PCR

• • Thermocycler – Wikipedia Artikel

Wo kommen die Primer für den Test her?

Wenn die gewünschte Sequenz bekannt ist, können die Primer über Sythesedienstleister bestellt werden.

Wie funktioniert die Sequenzierung?

• • Sequenzierung (Sanger und NGS) – Wikipedia Artikel

Wie kommt man an die Sequenz des Primers?

• • Plasmid – Wikipedia Artikel
  • Craig Venter – Wikipedia Artikel
  • Schrotschuss-Sequenzierung – Wikipedia Artikel

Elektrophorese

• • Elektrophorese – Wikipedia Artikel
  • Polyacrylamid-Gelelektrophorese – Wikipedia Artikel
  • Kapillarelektrophorese – Wikipedia Artikel

PCR-Test vs Sequenzierung

• • Echtzeit-PCR – Wikipedia Artikel
  • Cp/Ct-Wert – Wikipedia Artikel
  • SYBR Green I – Wikipedia Artikel

Weiterentwicklung mit TaqMan-Sonden

• • TaqMan-Sonden (auch Hydrolyse-Sonden) – Wikipedia Artikel

Stärken und Schwächen der PCR-Tests

• • Kreuzkontamination – Wikipedia Artikel
  • Uracil – Wikipedia Artikel
  • Thymidin – Wikipedia Artikel

PCR mit RNA

• • Reverse Transkription – Wikipedia Artikel
  • Reverse Transkriptase – Wikipedia Artikel
  • Hot start PCR – Wikipedia Artikel (eng.)

PCR als Standard in der Diagnostik

• • Pfu-Polymerase – Wikipedia Artikel

Weitere typische Anwendungsgebiete der PCR

• • Diagnostik – Wikipedia Artikel
  • Forensik – Wikipedia Artikel
  • Genetischer Fingerabdruck (Forensik) – Wikipedia Artikel
  • Genetischer Fingerabdruck – Youtube Video

NGS

• • Next Generation Sequencing – Flexicon
  • Stop-Motion – Wikipedia Artikel
  • Illumina-Sequenzierung – Flexicon
  • Brücken-PCR – Wikipedia Artikel

Ablauf einer Virussequenzierung

• • Nachweis von Corona Viren per RT PCR – Youtube Video

Isothermale PCR

• • Isotherme DNA-Amplifikation
  • Jörns Review als wissenschaftlicher Artikel (open access): Jörn Glökler, Theam Soon Lim, Jeunice Ida & Marcus Frohme (2021) Isothermal amplifications – a comprehensive review on current methods, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, DOI: 10.1080/10409238.2021.1937927

Jörns Werdegang

• • Universität Bayreuth
  • in-vitro-Evolution – Lexikon der Biologie – Spektrum
  • Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung
  • Phagen-Display – Wikipedia Artikel
  • Charité – Universitätsmedizin Berlin
  • Max-Planck-Institut für molekulare Genetik
  • Microarray – Wikipedia Artikel
  • Technischen Hochschule Wildau

Weitere Tätigkeiten von Jörn

• • digitale PCR – Wikipedia Artikel (eng.)
  • SELEX – Wikipedia Artikel
  • emulsions PCR
  • Volkswagenstiftung – Wikipedia Artikel

Jörns Lieblingsmolekül

• • T-Zell-Rezeptor – Wikipedia Artikel

Schematische Darstellung des T-Zell-Rezeptors. No machine-readable author provided. Anriar~commonswiki assumed (based on copyright claims)., CC BY-SA 3.0, via Wikimedia Commons

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Wir bedanken uns ganz herzlich bei Dr. Jörn Glökler für die Zeit und seine Erläuterungen und Ausführungen zu seinem Forschungsgebiet.

Wir freuen uns immer über Feedback: per Mail unter [e-mail], in den Kommentaren unter den einzelnen Episoden, über Twitter @wirkstoffradio oder auch als Bewertung bei iTunes/Apple-Podcasts oder panoptikum.social.

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Kapitel

1. Begrüßung (00:00:00)

2. Was bedeutet PCR? (00:01:51)

3. Primer Definition (00:10:08)

4. Polymerasetypen (00:11:51)

5. Die drei Schritte der technischen PCR (00:13:11)

6. Taq-Polymerase (00:17:22)

7. Was heißt überexprimiert? (00:20:16)

8. Automatisierung der PCR (00:21:02)

9. Wo kommen die Primer für den Test her? (00:23:59)

10. Wie funktioniert die Sequenzierung? (00:25:43)

11. Wie kommt man an die Sequenz des Primers? (00:28:32)

12. Elektrophorese (00:32:20)

13. PCR-Test vs Sequenzierung (00:37:50)

14. Weiterentwicklung mit TaqMan-Sonden (00:44:47)

15. Stärken und Schwächen der PCR-Tests (00:49:49)

16. PCR mit RNA (00:54:58)

17. PCR als Standard in der Diagnostik (01:00:48)

18. Weitere typische Anwendungsgebiete der PCR (01:03:04)

19. NGS (01:06:26)

20. Ablauf einer Virussequenzierung (01:23:00)

21. Isothermale PCR (01:26:28)

22. Jörns Werdegang (01:31:49)

23. Weitere Tätigkeiten von Jörn (01:36:43)

24. Jörns Lieblingsmolekül (01:52:49)

25. Verabschiedung und Bitte um Feedback (01:57:33)